Задачей настоящей работы является изучение спонтанной и индуцированной изменчивости продуцента холесеролоксидазы S. lavendulae с целью отбора из попул

1.1. Фермент холестеролоксидаза и его применение

1.2. Источники холестеролоксидазы

1.3. Свойства холестеролоксидазы

1.3.1. Холестеролоксидаза микробного происхождения

1.3.2. Локализация фермента в клетке

1.3.3. Типы холестеролоксидаз и их структура

1.3.4. Повышение выхода холестеролоксидазы

1.4. Естественная изменчивость продуцентов ферментов

1.5. Индуцированная изменчивость продуцентов ферментов

2.1. Объект исследования

2.2. Условия культивирования Streptomyces lavendulae продуцента холестеролоксидазы

2.3. Приготовление рабочей партии посевного материала на агаризованной питательной среде

2.4. Определение активности холестеролоксидазы по методу Ричмонда

2.5. Определение биомассы мицелия Streptomyces lavendulae

2.6. Методика моноспорового рассева и выявления активных клонов

2.7. Исследование динамики ферментативной активности штамма в генерациях

2.8. Методика обработки культуры УФ-лучами

Задачей настоящей работы является изучение спонтанной и индуцированной изменчивости продуцента холесеролоксидазы S. lavendulae с целью отбора из популяции актиномицета активного клона для создания конкурентоспособной технологии производства фермента

СОДЕРЖАНИЕ
Введение
1. Литературный обзор
1.1. Фермент холестеролоксидаза и его применение
1.2. Источники холестеролоксидазы
1.3. Свойства холестеролоксидазы
1.3.1. Холестеролоксидаза микробного происхождения
и ее свойства
1.3.2. Локализация фермента в клетке
1.3.3. Типы холестеролоксидаз и их структура
1.3.4. Повышение выхода холестеролоксидазы
1.4. Естественная изменчивость продуцентов ферментов
1.5. Индуцированная изменчивость продуцентов ферментов
2. Материалы и методы исследования
2.1. Объект исследования
2.2. Условия культивирования Streptomyces lavendulae продуцента холестеролоксидазы
2.3. Приготовление рабочей партии посевного материала на агаризованной питательной среде
2.4. Определение активности холестеролоксидазы
по методу Ричмонда
2.5. Определение биомассы мицелия Streptomyces lavendulae
2.6. Методика моноспорового рассева и выявление
активных клонов
2.7. Исследование динамики ферментативной активности штамма в генерациях
2.8. Методика обработки культуры УФ-лучами
2.9. Статистические методы обработки результатов
3. Результаты и обсуждение
3.1. Изучение спонтанной изменчивости
Streptomyces lavendulae
3.2. Изучение стабильности ферментативной активности штамма в генерациях
3.3. Изучение индуцированной изменчивости продуцента олестеролоксидазы под воздействием ультрафиолета. Подбор дозы облучения
4. Безопасность исследований
4.1. Характеристика условий труда
4.2. Микроклимат в помещении лаборатории
4.3. Вентиляция
4.4. Освещение
4.4.1. Естественное освещение
4.4.2. Искусственное освещение
4.5. Безопасность работ с веществами и материалами
4.5.1. Токсичные и горючие вещества
4.5.2. Биологические агенты
4.5.3. Категорирование лабораторного помещения
4.6. Безопасность оборудования. Электробезопасность
4.7. Безопасность работы на персональном компьютере
5. Охрана окружающей среды
5.1. Оценка источников загрязнения окружающей среды
5.1.1. Выбросы в атмосферу
5.1.2. Сточные воды
5.1.3. Образование и характеристика отходов
Заключение
Список использованной литературы

1. Всемирная организация здравоохранения [Электронный ресурс] : 10 ведущих причин смерти в мире / центр СМИ. – Электрон. дан. - 2014. – Информ. бюллетень № 310. – Режим доступа : http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs310/ru/. – Загл. с экрана.
2. Toyobo U.S.A., INC [Электронный ресурс] : Cholesterol oxidase from Streptomyces sp. / Products. – Электрон. дан. - 2013. – Режим доступа : http://www.toyobousa.com/enzyme-COO-311.html - Загл. с экрана.
3. Lata Kumari Cholesterol Oxidase and Its Applications / Lata Kumari, Shamsher S. Kanwar // Advances in Microbiology. – 2012. - № 2. – pp. 49-65.
4. Булдакова, Т.В. Оптимизация условий культивирования Streptomyces lavendulae для разработки технологии получения холестеролоксидазы – компонента диагностической тест-системы / Т.В. Булдакова, Е.П. Яковлева, В.А. Колодязная // Материалы VII Московского Международного Конгресса «Биотехнология: Состояние и Перспективы Развития» - М.: ЗАО «Экспо-био-химтехнологии», РХТУ им. Д.И. Менделеева, - 2013. – С. 197-198.
5. Булдакова, Т.В. Изучение спонтанной изменчивости Streptomyces lavendulae штамм ВКМ А-840Д для создания эффективной технологии получения холестеролоксидазы - компонента диагностических тест-систем для определения содержания холестерина в крови // Сборник материалов I Всероссийской научно-практической конференции с международным участием "Инновации в здоровье нации" - СПб: СПХФА – 2013.
6. Шапиро, Д. К. Практикум по биологической химии: 2-е изд. / Д. К. Шапиро. – Минск: Вышэйш. школа, 1976. -288 c.
7. Allain, C. C. Enzymatic determination of total serum cholesterol / С. С. Allain, L. S. Poon, C. S. G. Chan, W. Richmond, P. C. Fu // Clin. Chem. – 1974. - № 20. – pp. 470-475.
8. Fujishiro, K. Purification and properties of a new Brevibacterium sterolicum cholesterol oxidase produced by E. coli MM294/pnH10 / K. Fujishiro, H. Uchida, K. Shimokawa, M. Nakano, F. Sano, T. Ohta, N. Kayahara, K. Aisaka, T. Uwajima // FEMS Microbiol. Lett. – 2002. - № 215. – pp. 243-248.
9. Greenplate, J. T. Cholesterol oxidase: An oostatic and larvicidal agent active against the cotton boll weevil, Anthonomus grandis / J. T. Greenplate, N. B. Duck, J. C. Pershing, J. R. Purcell // Entomologia Experimentalis et Applicata. – 1995. - № 74. – pp. 253-258.
10. Isobe, K. Purification and some properties of cholesterol oxidase stable in detergents from 3-Proteobacterium Y-134 / K. Isobe, K. Shoji, Y. Nakanishi, M. Yokoe, N. Wakao // Biosci. Bioeng. – 2003. - № 95. – pp. 252-263.
11. А. с. 2005383 РФ. Способ снижения холестерина в пищевом продукте / А. Н. Климов, В. А. Нагорнев, К. А. Кожевникова, Л. Я. Петрова, Т. Г. Бабушкина, В. Ф. Трюфанов, Н. Н. Клюева, Е. В. Белова. - № 4758623/13 – заявл. 23.11.1989; опубл. 15.01.1994. – 5 с.
12. Turfitt, G. E. The Microbiological Degradation of Steroids. Oxidation of Cholesterol by Proactinomyces spp. / G. E. Turfitt // Journal of Biochemistry. – 1944. – Vol. 38, № 5. – pp. 49-62.
13. Schatz, A. The ability of Soil Microorganisms to Decompose Steroids / A. Schatz, K. Savard, I. J. Pinter // Journal of Bacteriology. – 1949. – Vol. 58, № 2. – pp. 117-125.
14. Stadtman, T. C. Studies on the Microbial Degradation of Cholesterol / T. C. Stadtman, A. Cherkes, C. B. Anfinsen // Journal of Biological Chemistry. – 1954. – Vol. 20, №6. – pp. 522-523.
15. Ferreira, N. P. Numerical Taxonomy of Cholesterol-Degrading Soil Bacteria / N. P. Ferreira, R. P. Tracey // Journal of Applied Bacteriology. – 1984. – Vol. 57, № 3. – pp. 429-446.
16. Kanchana, R. Production and Partial Characterisation of Cholesterol oxidase from Micrococcus sp. Isolated from Goa, India / R. Kanchana, D. Correia, S. Sarkar, P. Gawde, A. Rodrigues // International Journal of Applied Biology and Pharmaceutical Technology. – 2011. – Vol. 2, № 2. – pp. 393-398.
17. Actinomyces in biotechnology / edited by M. Goodfellow. – Elsevier, 1988. – 501 p.
18. Richmond, W. Preparation and properties of a bacterial cholesterol oxidase from Nocardia sp. and its application to enzyme assay of total cholesterol in serum / W. Richmond // Clin. Chem.– 1973. - № 19. – pp. 1350–1356.
19. Smith, A. G. Cholesterol Oxidases: properties and application / A. G. Smith, C. J. W. Brooks // Journal of Steroid Biochemistry. – 1976. – Vol. 7. – pp. 705-713.
20. Doukyu, N. Characteristics and Biotechnological Applications of Microbial Cholesterol Oxidase / N. Doukyu // Applied Microbiology and Biotechnology. – 2009. – Vol. 83, № 5. – pp. 825-837.
21. Nishiya, Y. Improvement of thermal stability of Streptomyces cholesterol oxidase by random mutagenesis and a structural interpretation / Y. Nishiya, N. Harada, S. Teshima, M. Yamashita, I. Fujii, N. Hirayama, Y. Murooka // Protein Engeneering. – 1997. – Vol. 10, № 3. – pp. 231-235.
22. Yue, Q. K. Crystal structure determination of cholesterol oxidase from Streptomyces and structural characterization of key active site mutants / Q. K. Yue, I. J. Kass, N. S. Sampson, A. Vrielink // Biochemistry. – 1999. - № 38. – pp. 4277-4286.
23. Lartillot, S. Extracellular Cholesterol Oxidase from Streptomyces Strain / S. Lartillot, P. Kedziora // Preparative Biochemistry and Biotechnology. – 1990. – Vol. 20. – pp. 51-62.
24. Chauhan, A. K. Medium optimization by orthogonal array and response surface methodology for cholesterol oxidase production by Streptomyces lavendulae NCIM 2499 / A. K. Chauhan, S. A. Survase, J. Kishenkumar, U. S. Annapure // J. Gen. Appl. Microbiol. – 2009. - № 55. – pp. 171-180.
25. Lee, M. T. Nutritional factors that affect the production of cholesterol oxidase by Rhodococcus equi no. 23 / M. T. Lee, W. C. Chen, C. C. Chou // Biotechnol. Appl. Biochem. – 1997. - № 3. – pp. 159-162.
26. Murooka, Y. Cloning and expression of Streptomyces cholesterol oxidase gene in Streptomyces lividans with plasmid plJ702 / Y. Murooka, T. Ishizaki, O. Nimi, N. Maekawa // Appl. Environ. Microbiol. – 1986. - № 52. – pp. 1382-1385.
27. Sampson, N. S. Increased expression of Brevibacterium sterolicum cholesterol oxidase in Escherichia coli by genetic modification / N. S. Sampson, X. Chen // Protein Express Purif. – 1998. - № 12. – pp. 347-352.
28. Volonte, F. Production of recombinant cholesterol oxidase containing covalently bound FAD in Escherichia coli / F. Volonte, L. Pollegioni, G. Molla, L. Frattini, F. Marinelli, L. Piubelli // BMC Biotechnology. – 2010. - № 10. – p. 33.
29. Алиханян, С. И. Селекция промышленных микроорганизмов / С. И. Алиханян. – М. : Наука, 1968. – 392 с.
30. Лысак, В. В. Микробиология : учеб. пособие / В. В. Лысак. – Мн.: БГУ, 2005. – 263 с.
31. Жукова, Р. А. Методы селекции продуцентов антибиотиков и ферментов / Р. А. Жукова, А. Д. Коммунарская, М. И. Пронина, И. М. Терешин, Н. П. Журавлева, М. Н. Шабас. – Л.: Медицина, 1978. – 160 с.
32. Adrio, J. L. Genetic improvement of processes yielding microbial products / J. L. Adrio, A. L. Demain // FEMS Microbial Rev. – 2006. - № 30. – pp. 187-214.
33. Биотехнология: учеб. пособие для вузов. Т. 2 / под. ред. Н. С. Егорова, В. Д. Самуилова. – М.: Высшая школа, 1987. – 159 с.
34. Прист, Ф. Внеклеточные ферменты микроорганизмов / Ф. Прист. – Мир, 1987. – 117 с.
35. Михайлова, Р. В. Изучение спонтанной изменчивости Penicillium adamatzii ЛФ F-2044 – продуцента глюкооксидазы / Р. В. Михайлова, Л. А. Жуковская, А. Г. Лобанок // Прикладная биохимия и микробиология. – 2007. – т. 43, № 2. – С. 229-233.
36. Котов, В. Б. Селекция микроорганизмов-продуцентов ферментов с использованием мутагенных факторов // В. Б. Котов. С. А. Коновалов // Микроб. пром. – 1970. - № 3. – С. 35-45.
37. Колодязная, В. А. Локализация фермента холестеролоксидазы в культуре актиномицета / В. А. Колодязная, Е. П. Яковлева, О. В. Топкова, Т. В. Булдакова // Естественные и технические науки. – 2010. - №5. – С. 172-174.
38. Султанова, И.Г. Естественная диссоциация штамма Streptomyces atratus – продуцента глюкозоизомеразы / И. Г. Султанова // Узбекский биологический журнал. – 1990. - № 3. - С. 12-15.
39. Advances in genetics. Vol. 20 / edited by E. W. Caspari. – Academic press, 1979. – 463 p.
40. Храмцова, Е. А. Селекция продуцентов : курс лекций / Е. А. Храмцова, Н. П. Максимова. – Мн.: БГУ, 2011. – 132 с.
41. Сборник методик по генетике микроорганизмов / под ред. Р. Клауса, У. Хейса. – М.: Медицина, 1970. – 248 с.
42. Ферменты микроорганизмов / под ред. А. А. Имшенецкого. – М.: Наука, 1973. – 316 с.
43. Crawford, D. L. Genetic manipulation of lignolytic Streptomyces and improved lignin-to-chemical bioconversion strains / D. L. Crawford, T. M. Pettey, B. M. Thede, L. A. Deobald // Biotechnol. Bioeng. Symp. – 1984. - № 14. – pp. 241-256.
44. Шмид, Р. Наглядная биотехнология и генетическая инженерия / Р. Шмид; пер. с нем. – М.: БИНОМ Лаборатория знаний, 2014. – 325 с.
45. Булдакова, Т. В. Использование альтернативных источников органического азота при биосинтезе холестеролоксидазы / Т. В. Булдакова, В. А. Колодязная // Actualni vymozenosti vedy. – 2012. – Dil 17. – C. 35-38.