Активность кальцийзависимых протеиназ в мозге крыс с экспериментальной нейропатологией

ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Кальпаин/кальпастатиновая протеoлитическая система
1.2 Биохимические механизмы развития нейродегенеративных заболеваний
ГЛАВА 2.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1 Реагенты и приборы
2.2 Моделирование нейродегенерации у лабораторных животных
2.3 Анализ биохимических показателей
2.3.1 Экстракция белков из тканей
2.3.2 Определение активности кальпаинов
2.3.3 Зимография с казеином
2.3.4 Электрофорез белков полиакриламидном геле
2.3.5 Вестерн-блот анализ
2.3.6 Другие методы
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Кальпаин/кальпастатиновая система у крыс, подвергнутых индуцированной бета-амилоидом нейродегенирации на фоне эстрогенной терапии
3.2 Кальпаин/кальпастатиновая система у крыс, подвергнутых глутамат-индуцированной нейродегенирации на фоне терапии потенциальными нейропротекторами
ВЫВОДЫ
ЗАКЛЮЧЕНИЯ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ

Нейродегенеративные заболевания ‒ болезни Альцгеймера, Паркинсона и другие – представляют в странах с высокой продолжительностью жизни населения огромную медицинскую, социальную, финансовую и научную проблему. Распространенность этих заболеваний растёт по мере старения населения, и большинство развитых стран уже сейчас оказывают специальную поддержку исследованиям в области изучения нейродегенеративных заболеваний.
К настоящему времени участие внутриклеточных протеиназ в нейродегенеративных процессах не вызывает сомнений. С одной стороны, недостаточная интенсивность протеиназозависимых процессов при нейродегенеративных заболеваниях способствует накоплению большого количества патологических белков, например, бета-амилоида и тау-протеина при болезни Альцгеймера, альфа-синуклеина при болезни Паркинсона и других. С другой стороны, протеиназы регулируют основные пути гибели клеток при нейродегенерации – апоптоз, некроз и аутофагию.
...

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1.Кальпаин / кальпастатиновая протеолитическая система.

Кальпаин / кальпастатиновая протеолитическая система регулирует широкий спектр клеточных процессов. (Goll et al., 2003; Немова 2010). Она представлена во всех тканях млекопитающих основными формами Са2+-зависимых цистеиновых протеиназ – μ- и m-кальпаинами (КФ 3.4.22.52 и 3.4.22.53, соответственно) и их ингибитором – кальпастатином. (Goll et al., 2003; Nixon 2003) Эта высокочувствительная и эффективная система из трех основных компонентов (протеиназ, ингибитора и активатора – Са2+) связана взаимной регуляцией ее составляющих.
...

2.1 Реагенты и приборы

В работе были использованы соли, химические реагенты, ингибиторы протеиназ, белковые субстраты, маркеры молекулярных масс, очищенный кальпаин 1 человека, красители, 17β-эстрадиол, L-глутаминовая кислота, нифедипин («Sigma-Aldrich», США), компоненты для вестерн-блот анализа («Bio-Rad», США), поликлональные антитела к кальпастатину sc-20779 и конъюгированные с пероксидазой антитела к IgG кролика sc-2004 («Santa Cruz Biotechnology», США). Предподготовка пептида Aβ1-40 («Sigma-Aldrich», США) включала его растворение в стерильном 0.9% NaCl до конечной концентрации 2.5 г/л и инкубацию раствора при 37 °С в течение недели для агрегации пептида.
...

2.2 Моделирование нейродегенерации у лабораторных животных

Исследование проведено на одно- (серии эксперимента I и II) и двухлетних (серия III) крысах Вистар, самцы массой 300 ± 30 г, самки – 250 ± 30 г. Животных содержали в стандартных виварных условиях при естественном световом режиме и свободном доступе к воде и пище. Способы воздействия на животных в трех сериях эксперимента обобщены в таблице 1.
В каждой серии эксперимента произвольно выделяли четыре группы животных (в каждой n = 7-10): 1) интактные; 2) контрольные – ложно-оперированные; 3) подвергнутые введению нейротоксичного агента; 4) подвергнутые введению нейротоксичного агента на фоне введения потенциального нейропротектора.

Таблица 1. Схема экспериментов с лабораторными животными. Дозы, длительность и способ введения веществ приведены в тексте.

Ложнооперированные животные (группа животных 2), подвергались однократной инъекции 2 мкл 0.9% раствора NaCl в C1-область правого гиппокампа.
...

2.3.1 Экстракция белков из тканей

У лабораторных животных (крыс) для последующего биохимического анализа были взяты образцы нервной ткани – гиппокампа и коры больших полушарий. Учитывая дисперсность пула кальпаинов в клетке, связанную со спецификой их регуляции, определяли показатели как в цитозольной фракции клеток, так и во фракции мембрано-связанных белков, полученных по методу (Enns, Belcastro, 2006). Цитоплазматическую фракцию получали из ткани, гомогенизированной в 20 мМ Трис-HCl-буфере (рН 7.5) с добавлением 80 мМ КСl, 5 мМ Na-соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA) и 20 мМ дитиотреитола (DTT) (соотношение 1:10, вес/объем) с последующим центрифугированием (20 000 g, 20 мин). Фракцию мембраносвязанных белков – повторным центрифугированием (20 000 g, 20 мин) получившегося осадка, предварительно ресуспендированного в равном объеме того же буфера с добавлением 0.33% тритона X-100. Буфер для гомогенизации включал смесь ингибиторов протеиназ: лейпептина (0.
...

2.3.2 Определение активности кальпаинов

В полученных фракциях цитозольных и мембраносвязанных белков оценивали активность кальпаинов – Са2+-зависимую казеинолитическую активность, чувствительную к ингибиторам цистеиновых протеиназ (Enns, Belcastro, 2006). Реакционная смесь, объемом 500 мкл, включала 0.5 мг казеина, денатурированного щелочью, 20 мМ DTT, 200 мкл ферментной фракции и 2.5 мМ СаСl2 или EDTA (для оценки Са2+-зависимой и Са2+-независимой активности, соответственно) в 50 мМ Трис-HCl-буфере (рН 7.5). После 30-минутной инкубации (28°С) в аликвотах 100 мкл спектрофотометрически определяли содержание остаточного белка по методу Брэдфорд (Bradford, 1976). Единицу активности кальпаинов (ед.акт.) определяли как количество фермента, вызывающее увеличение оптического поглощения на 0.1 OE при 595 нм за 1 ч реакции в указанных условиях. Удельную активность определяли в расчете на 1 мг белка соответствующей фракции.
1. Буфер для реакции (объём 500 мл)
• 20 мМ ДТТ, навеска 1.
...

1) Бондарева Л.А., Немова Н.Н., Кяйвяряйнен Е.И. Внутриклеточная Са2+-зависимая протеолитическая система животных. М.: Наука, 2006. 304 с.
2) Немова Н.Н., Лысенко Л.А., Канцерова Н.П., Протеазы семейства кальпаинов. Структура и функции. Отногенез. 2010. Т. 41. (5): 381-389.
3) Nixon R.A. // Ageing Res. Rev. 2003. V. 2. P. 407–418.

4) Siman R., Noszek J.C. // Neuron. 1988. V. 1. P. 279-287.
5) Carragher N.O., Walker S.M., Scott Carragher L.A., Harris F., Sawyer T.K., Brunton V.G., Ozanne B.W., Frame M.C. // Oncogene. 2006. V. 25. P. 5726–5740.
6) Chakraborti S., Alam M.N., Paik D., Shaikh S., Chakraborti T. // Indian J. Biochem. Biophys. 2012. V. 49(5). P. 316-328.
7) Moldoveanu T., Gehring K., Green D.R. // Nature. 2008. V. 456. P. 404-408.
8) Averna M., De Tullio R., Capini P., Salamino F., Pontremoli S., Melloni E. // Cell. Mol. Life Sci. 2003. V. 60. P. 2669–2678.
9) Hanna R.A., Campbell R.L., Davies P.L. // Nature. 2008. V. 456. P. 409-413.
10) Berridge M.J., Bootman M.D., Roderick H.L. // Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2003. V. 4(7). P. 517-529.
11) Bevers M.B., Neumar R.W. // J. Cereb. Blood Flow Metab. 2008. V. 28(4). P. 655-673.

12) Алтаева Э.Г., Лысенко Л.А., Канцерова Н.П., Немова Н.Н., Шенкман Б.С. // Докл. АН. 2010. Т. 433. № 1. С. 138-141.
13) Atherton J., Kurbatskaya K., Bondulich M., Croft C.L., Garwood C.J., Chhabra R., Wray S., Jeromin A., Hanger D.P., Noble W. // Aging Cell. 2014. V. 13. P. 49–59.
14) Abele K., Yang J. // Acta Physiologica Sinica. 2012. V. 64(5). P. 504–514.
15) Carrell R.W., Lomas D.A. Conformation disease// Lancet. 1997. V. 350. P. 134-138.
16) Hardy J. // J. Neurochem. 2009. V. 110. P. 1129-1134.
17) Grundke-Iqbal I., Iqbal K., Tung Y.C., Quinlan M., Wisniewski H.M., Binder L.I. // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1986. V. 83. P. 4913-4917.
18) La Ferla F. // Nat. Rev. Neurosci. 2002. V. 3. P. 862-872
19) Tydlacka S., Wang C.E., Wang X., Li S., Li X.J. Differential activities of the ubiquitin-proteasome system in neurons versus glia may account for the preferential accumulation of misfolded proteins in neurons // J. Neurosci. 2008. V. 28. P. 13285-13295.
20) Danysz W., Parsons C.G. // Brit. J. Pharmacol. 2012. V. 167. P. 324–352.
21) Berry J.N., Sharrett-Field L., Butler T.R., Prendergast M.A. // Neurosci. 2012. V. 222. P. 147–158.
22) Vaisid T., Kosower N.S., Elkind E., Barnoy S. // J. Neurosci. Res. 2008. V. 86. P. 2314-2325.
23) Vosler P.S., Brennan C.S., Chen J. // Mol. Neurobiol. 2008. V. 38. P. 78-100.
24) Bezprozvanny I. Calcium signaling and neurodegenerative diseases // Trends Mol. Med. 2009. V. 15. P. 89-100.
25) Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976. V. 72. P. 248-254.
26) Enns D.L., Belcastro A.N. Early activation and redistribution of calpain activity in skeletal muscle during hindlimb unweighting and reweighting // Can. J. Physiol. Pharmacol. 2006. V. 84. P. 601-609.
27) Figueiredo-Petera M.E., Efthimiopoulos S., Tezapsidis N. Distinct secretases, a cysteine protease and serine protease, generate the C-termini of amyloid β-proteinase Aβ 1-40 and Aβ 1-42, respectively // J. Neurochem. 1999. Vol. 72. P. 1417-1422.
28) Goll D.E., Thompson V.F., Li H., Wei W., Cong J. Calpain system // Physiol. Rev. 2003. Vol. 83,N 3. P. 731-801
29) Grynspan F., Griffin W.R., Catalado A. Active site-directed antibodies identify calpain II as early-appearing and pervasive component of neurofibrillary pathology in Alzheimer’s disease // Brain Res. 1997. Vol. 763. P. 145-158.
30) Guttmann R.P., Johnson G.V.W. Calpain-mediated proteolysis of neuronal structural proteins // Calpain–Pharmacology and Toxicology of Calcium-dependent Protease, Taylor & Francis, Philadelphia, PA. – 1999. – С. 229-249.
31) Han P., Dou F. et al. Suppression of cyclin-dependent kinase 5 activation by amyloid precursor protein: a novel excitoprotective mechanism involving modulation of tau phosphorylation //J. Neurosci. 2005. Vol. 25, N 50. P. 11542-11552
32) Hood J.L., Brooks W.H., Roszman T.L. Differential compartmentalization of the calpain/calpastatin network with the endoplasmic reticulum and Golgi apparatus // J. Biol. Chem. 2004 V. 279. P. 43126-43135
33) Kolchinskaya L.I., Malysheva M.K. Activity of calpain in subcellular fractions of the rat brain // Neurophysiol. 2004. V. 36. P. 265-271.
34) Kusakawa G.-I., Saito T., Oonuki R. Calpain-dependent proteolytic cleavage of the p35 cyclin-dependent kinase activator to p25 // J. Biol. Chem. 2000. Vol. 275. p. 17166-17172.
35) Lee M.-S., Kwon Y. T., Li M., Peng J., Friedlander R.M., Tsai L.H. Neurotoxicity induces cleavage of p35 to p25 by calpain // Nature. 2000. Vol. 405. P. 360-364.
36) Leissring M.A., Akbari Y., Fanger C. M. et al. Capacitative calcium entry deficits and elevated luminal calcium in mutant presenilin-1 knockin mice // J. Cell. Biol. 2000. Vol. 149. P. 793-797.
37) Litersky J.M., Johnson G.V. Phosphorylation by cAMP-dependent protein kinase inhibits the degradation of tau by calpain // J. Biol. Chem. 1992. Vol. 267. P. 1563-1568
38) Marcilhac A. Intracellular signaling pathways, apoptosis and neurodegenerative diseases // Psychologie & neuropsychiatrie du vieillissement. 2004. Т. 2. №. 3. С. 203-214.
39) Marcum J. L., Mathenia J. K., Chen R., Cuttmann R.P. Oxidation of thiol-proteases in the hippocampus of Alzheimer’s disease // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005. Vol. 334, N 2. P. 342-348
40) Mellgren R.L. Canine cardiac calcium-dependent proteases: resolution of two forms with different requirements for calcium // FEBS Lett. 1980. V. 109. P. 129-133.
41) Morris R.G.M. Spatial localization does not require the presence of local cues // Learn. Motiv. 1981. V. 2. P. 239-260.
42) Nixon R.A., Mohan P. Calpains in the pathogenesis of Alzheimer’s disease // Calpain: Pharmacology and toxicology of calcium-dependent protease / Ed. by K.K.W. Wang, P.-W. Yuen. Philadelphia (PA): Taylor and Francis, 1999. P. 229-249.
43) Nixon R.A., Saito K.I., Grynspan F., Griffin W.R., Katayama S., Honda T., Mohan P.S., Shea T.B., Beermann M. Calcium-activated neutral proteinase (calpain) system in aging and Alzheimer's disease // Ann. N-Y Acad. Sci. 1994. V.747. P. 77-91.
44) Rawlings N.D., Barrett A.J., Bateman A. MEROPS: the peptidase database // Nucleic Acids Res. 2012. V. 40. P. D343-D350.
45) Saito K-I., Elce J.S., Hamos J.E., Nixon R.A. Widespread activation of calcium-activated neutral proteinase (calpain) in the brain in Alzheimer’s disease: a potential molecular basis for neuronal degeneration // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1993. Vol. 90. P. 2628-2632.
46) Selkoe D.J. Alzheimer disease: genes, proteins, and therapy // Physiol. Rev. 81. 2001. Vol. 81. P. 741-766.
47) Tymianski M., Charlton M.P., Carlen P.L., Tator C.H. Source specificity of early calcium neurotoxicity in cultured embryonic spinal neurons // J. Neurosci. 1993. V. 13.P. 2085-2104.
48) Vaisid T., Kosower N.S., Katzav A., Chapman J., Barnoy S. Amyloid b peptide toxicity in differentiated PC12 cells: Calpain-calpastatin, caspase, and membrane damage // Neurochem. Int. 2007. V. 51. P. 391-397.
49) Wu H.Y., Tomizawa K., Matsui H. Calpain–calcineurin signaling in the pathogenesis of calcium-dependent disorder // Acta Med. Okayama. 2007. V. 61. P. 123-137.
50) Yamashima T. Ca2+-dependent proteases in ischemic neuronal death: a conserved “calpain-cathepsin cascade” from nematodes to primate // Cell Calcium. 2004. Vol. 36, N 3-4. P. 285-293.
51) Коросов А.В., Горбач В.В. Компьютерная обработка биологических данных. Петрозаводск: ПетрГУ, 2007.
52) Немова Н.Н., Лысенко Л.А., Канцерова Н.П. Протеиназы семейства кальпаинов. Структура и функции // Онтогенез. 2010. Т. 41. С. 381-389.
53) Рендаков Н.Л., Лысенко Л.А., Люпина Ю.В., Шарова Н.П., Сельверова Н.Б., Немова Н.Н. Роль лизосомальных протеиназ и эстрадиола в нейродегенерации, индуцированной бета-амилоидом // Докл. АН. 2014