СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ УРОВНЯ ИММУНОЭКСПРЕССИИ БЕЛКОВ ТЕПЛОВОГО ШОКА HSP 25 И HSP 70 В МОТОНЕЙРОНАХ ПОЯСНИЧНОГО И ШЕЙНОГО ОТДЕЛА СПИННОГО МОЗГА МЫШ

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ 4
Цели и задачи 6
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
1.1 Белки теплового шока 7
1.2 Роль белков теплового шока в нервной ткани. 9
1.3 Эффекты невесомости на нервно-мышечную систему 11
1.4 Моделирование эффектов невесомости 16
1.4.1 Моделирование эффектов невесомости на Земле 16
1.4.2 Механизмы выживаемости спинальных мотонейронов у крыс при моделировании гипогравитации на Земле. 23
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 25
2.1. Объект исследования 25
2.2 Модель антиортостатического вывешивания задних конечностей 25
2. 3. Гистологические методы 25
2. 4. Иммуногистохимическое окрашивание 26
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 28
3.1. Влияние антиортостатического вывешивания на уровень иммуноэкспресии hsp 25 в мотонейронах поясничного отдела спинного мозга мыши 28
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 37
ВЫВОДЫ 39
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 40

1.1 Белки теплового шока
Белки теплового шока (HSP) или стресс-белки являются высококонсервативными и присутствуют во всех организмах и во всех клетках организмов. HSP, также известные, как и шапероны, играют решающую роль в свертывании и разворачивании белков, сборке мультипротеиновых комплексов, транспорте и сортировке белков в правильные субклеточные компартменты, контроле и передаче клеточного цикла и защите клеток от стресса и апоптоза. Совсем недавно HSP участвовали в представлении антигена в роли сопровождения и переноса антигенных пептидов в молекулы I и II класса основных гистосовместимых комплексов.

Кроме того, внеклеточные HSP могут стимулировать профессиональные антигенпредставляющие клетки иммунной системы, такие как макрофаги и дендритные клетки. HSP представляют собой большое семейство белков, которые часто классифицируются на основе их молекулярной массы: hsp10, hsp40, hsp60, hsp70, hsp90 и т. д [Li, Srivastava, 2004] .
...

1.2 Роль белков теплового шока в нервной ткани.
Исходя из современных представлений, большое значение в развитии реперфузионных процессов имеют hsp семейства HSP70, вырабатывающиеся при различных видах стрессовых воздействий и играют существенную роль в адаптации, восстановлении и защите клеток. Белки семейства HSP70 являются хорошим индикатором общего патофизиологического стрессового ответа на ишемию, но не всегда маркером нейронального выживания, другие белки являются нейропротекторами. Однако в то же время остается неясным,
что происходят в мозге, а именно в высокочувствительных к гипоксии нейрональных популяциях, после тотальной ишемии организма (клинической смерти).
В условиях «нормальной» жизнедеятельности белки теплового шока являются участниками регуляции процессов роста, переноса генетического материала, развития, сигнальной передачи, гибели клеток.
...

1.3 Эффекты невесомости на нервно-мышечную систему.
Предшественниками первого полёта человека в космос были многократные полёты животных на космических ракетах и других различных аппаратах, предназначенных для полета в космос. По мере развития космических полётов человека и удлинения их продолжительности стало очевидным необходимость в продолжении проведения лётных экспериментов на животных. В ходе развития космонавтики от экспериментов на лабораторных животных требовалось решение фундаментальных проблем жизни в космосе и оценка возможного повреждающего влияния на организм факторов полета в космос.
В связи с высокой значимостью биологических экспериментов в космосе, в январе 1970 г. было издано постановление о создании биологических спутников "Бион" и проведении на них экспериментальных исследований в интересах дальнейшего совершенствования системы медицинского обеспечения пилотируемых полётов различной степени сложности и различной продолжительности.
...

1.4.1 Моделирование эффектов невесомости на Земле
С создания в Национальном научно-исследовательском центре по аэронавтике и исследованию космического пространства (НАСА) в середине 1970-х годов во многих лабораториях по всему миру использовали экспериментальную модель выгрузки задней челюсти для создания невесомости и изучения разнообразных аспектов мышечно-скелетной нагрузки. В данной модели задние конечности грызунов поднимаются, для создания угла наклона головы на 30 градусов, приводящее к сдвигу жидкости в цефаладе, что позволяет избежать тяжелой нагрузки на задние конечности.
Так как главным фактором является отсутствие силы тяжести - создание невесомости на Земле невозможно. В экспериментах используются различные модели отдельных биологических эффектов невесомости.
В этом разделе рассмотрена история модели разгрузки задней конечности с технической точки зрения. Многие экспериментальные лаборатории участвовали в определении главных характеристик модели.
...

1.4.2 Механизмы выживаемости спинальных мотонейронов у крыс при моделировании гипогравитации на Земле.
Мышечная слабость, атония и атрофия скелета мышечных волокон представляют собой двигательный синдром гипогравитации, который развивается в ответ на микрогравитацию. Интересно отметить, что подобные патологические расстройства происходят в скелетной мускулатуре в случае дегенерации спинномозговых мотонейронов. Однако остается открытым вопрос, что является основным триггером изменений в ткани скелетных мышц в условиях микрогравитации? Было допущено, что фактор, вызывающий развитие синдрома гипогравитации связан с нервной системой. Нейроморфологические исследования на лабораторных животных в условиях микрогравитации продемонстрировали снижение функциональной активности спинномозговых мотонейронов.
...

2. 4. Иммуногистохимическое окрашивание.
Полученные срезы окрашивали непрямым иммунопероксидазным методом. Первичные антитела применяли в разведении: Hsp25/27 – белок теплового шока с молекулярной массой 25 кДа (1:200, SantaCruz Biotechnology Inc, США); Hsp70/72 – белок теплового шока с молекулярной массой 70 кДа (1:200, SantaCruz Biotechnology Inc, США). Инкубацию с поликлональными первичными антителами проводили в течение 12 часов при температуре +4ºС. Для иммунной реакции с первичными антителами был применён стрептавидин-биотиновый комплекс Elite ABC Kit (Invitrogen, США). Иммунопреципитат визуализировали при помощи диаминбензидина (DAB Substrate Kit for Peroxidase; Vector Laboratories, США). После окрашивания срезы монтировали на предметных стёклах, высушивали, заключали в водорастворимую среду.

2. 5. Получение и анализ изображений.
Изображения микропрепаратов получали на микроскопе OlympusBX51WIс помощью камеры AxioCamMRm (CarlZeiss, Германия) и программы AxioVisionRel. 4.
...

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Влияние антиортостатического вывешивания на уровень иммуноэкспресии hsp 25 в мотонейронах поясничного отдела спинного мозга мыши.
Окрашивание поперечных срезов поясничного и шейного отделов спинного мозга специфичными антителами к hsp 25 у контрольных и подопытных животных выявило его присутствие в нервных клетках. На рисунке 1и 2 представлены поперечные срезы поясничного и шейного отделов спинного мозга мышей контрольной группы (А) и группы после 30 суток антиортостатического вывешивания задних конечностей (Б). Из рисунков видно, что в мотонейронах hsp 25 локализован в области перикариона у животных обеих групп в мотонейронах как шейного, так и поясничного отделов. При этом в мотонейронах поясничного отдела контрольных животных интенсивность окрашивания несколько ниже, чем у подопытных животных после антиортостатического «вывешивания». Кроме того у подопытных животных исследуемый белок наблюдается еще и в области аксонов.
...

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В настоящей работе был проведен сравнительный анализ иммуноэкспрессии белков теплового шока с молекулярной массой 25 и 70 кДа в мотонейронах поясничного и шейного отделов спинного мозга мышей после 30 суточного антиортостатического вывешивания задних конечностей. Интерес сопоставления реакции мотонейронов двух утолщений спинного мозга обусловлен тем, что условия «вывешивания» задних конечностей по разному отражаются на двигательных нейронах поясничного отдела и шейного отделов. Так, первые инеррвируют скелетные мышцы задних конечностей, находящиеся в условиях функциональной разгрузки при
«вывешивании», в то время, как, мотонейроны шейного отдела, иннервирующие скелетные мышцы передних конечностей, которые напротив нагружены при антиортостатическом вывешивании существенно больше, чем в естественных условиях.
...

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Afzal, E. [Text] Potential role of heat shock proteins in neural differentia- tion of murine embryonal carcinoma stem cells (P19) /E. Afzal, M. Ebrahimi, S.M. Najafi, A. Daryadel, H. Baharvand / Cell Biol Int. –
2011. – V.35. - №.7. – P.713-20.
2. Allen, J. P. [Text] A Review of Research on the Alcohol Use Disorders Identification Test/ J. P. Allen, Z.L.Raye, B.F. Joanne B, B. Thomas / Al- coholism: Clinical and Experimental Research. - 1997. -V.21. – P. 613-
619.
3. Desplanches, B. [Text] Numerical analysis of helical antennas backed by finite ground planes/ B. Desplanches, A. Sharaiha A., C. Terret / Microw.
Opt. Technol. Lett. – 1997. – V. 15. – P. 352–355.
4. Dong, X. [Text] Control of G1 in the developing Drosophila eye: rca1 regulates Cyclin A / X. Dong, K.H. Zavitz, B.J. Thomas, M. Lin, S. Campbell, S.L. Zipursky / Genes Dev. - 1997. – V. 11. - №.1. –P. 94 -
105.
5. Edgerton, V.R. [Text] Neuromuscular adaptation to actual and simulated
weightlessness/ V.R. Edgerton, R.R. Roy / Adv Space Biol Med. – 1994. V.4. – P. 33-67.
6. Evdonin, A. L. [Text] Phospholipse c Inhibitor, u73122, Stimulates Re- lease of Hsp-70 Stress Protein from A431 Human Carcinoma Cells/ A.L. Evdonin, I.V. Guzhova, B.A. Margulis, N.D. Medvedeva / Cancer Cell
International. – 2004. –V.4. - №.2. - P.1475-2867.
7. Evdonin, A.L. [Text] Extracellular heat shock protein 70 mediates heat stress-induced epidermal growth factor receptor transactivation in A431 carcinoma cells/ A.L, Evdonin, I.V. Guzhova, B.A. Margulis, N.D.
Medvedeva / FEBS Lett. – 2006a. – V. 580. – P.28-29.
8. Evdonin, L.A. [Text] The release of Hsp70 from A431 carcinoma cells is mediated by secretory-like granules / A.L. Evdonin,M.G. Martynova,
O.A. Bystrova, I.V. Guzhova, B.A. Margulis, N.D. Medvedeva / Euro- pean Journal of Cell Biology. – 2006. -V.85, - I.6. – P. 443-455.

9. Gehrmann, M. [Text] Retinoid- and sodium-butyrate-induced decrease in heat shock protein 70 membrane-positive tumor cells is associated with reduced sensitivity to natural killer cell lysis, growth delay, and altered growth morphology /M. Gehrmann, J. Schonberger,T. Zilch, L. Ross- bacher, G.Thonigs, C. Eilles, G. Multhoff / Cell Stress Chaperones. –
2005. – V.10. - №.2. – P.136-46.
10. Georgopoulos, C. and Welch, W.J. [Text] Role of the major heat shock proteins as molecular chaperones / C. Georgopoulos, W.J. Welch /Annu
Rev Cell Biol. – 1993. – V. 9. – P.601-34.
11. Globus, R.K. [Text] The temporal response of bone to unloading / R.K. Globus, D.D. Bikle, E. Morey-Holton / Endocrinology. – 1986. –V. 118.
– P.733–742.
12. Guzhova, I. [Text] In vitro studies show that Hsp70 can be released by glia and that exogenous Hsp70 can enhance neuronal stress tolerance / I. Guzhova, K. Kislyakova, O. Moskaliova, I. Fridlanskaya, M. Tytell, M.
Cheetham, B. Margulis / Brain Res. – 2001. - V.28. - №.914. – P. 66-73. 13.Guzhova, I.V., Margulis, B.A. [Text] Induction and accumulation of
HSP70 leads to formation of its complexes with other cell proteins/ I.V. Guzhova, B.A. Margulis /Tsitologiia. – 2000. – V.42. - №.7. - P.647-52.
14. Guzhova, I.V., Margulis, B.A. [Text] Hsp70 chaperone as a survival fac-
tor in cell pathology / I. Guzhova, B. Margulis / Int Rev Cytol. – 2006. – V. 254. – P.101-49.
15. Hargens, A.R. [Text] Tissue fluid shift, forelimb loading, and tail tension
in tail - suspended rats / A.R. Hargens, J. Steskal, C. Johansson, C.M. Tipton / Physiologist. - 1984. – V.27. – P.37–38.
16. Hartl, F.U. [Text] Molecular chaperones in cellular protein folding/ F.U.
Hartl / Nature. – 1996. - V.381. - №.6583. – P.571-9.
17. Hightower, L.E., Guidion, P.T. Jr. [Text] Selective release from cultured mammalian cells of heat-shock (stress) proteins that resemble glia-axon transfer proteins /L.E. Hightower, P.T. Jr. Guidon /J Cell Physiol. – 1989.
– V.138. - №2. – P.257-66.
18. Hunter-Lavin, C. [Text] Hsp70 release from peripheral blood mononu- clear cells / C. Hunter-Lavin, E.L. Davies, M.M. Bacelar, M.J. Marshall,

S.M. Andrew, J.H. Williams / Biochem Biophys Res Commun. – 2004. –
V.12. -№. 324(2). – P.511-7.
19. Hut, H.M. [Text] Hsp70 protects mitotic cells against heat-induced cen- trosome damage and division abnormalities/ H.M. Hut H, H.H. Kampinga, O.C. Sibon / Mol Biol Cell. – 2005. – V.16. - №.8. P. - 3776-
85.
20. Jaattela, M. [Text] Hsp70 exerts its anti-apoptotic function downstream of caspase-3-like proteases/ M. Jaattela, D. Wissing, K. Kokholm, T. Kallunki, M. Egeblad / EMBO J. – 1998. – V. 2. - №.17 (21). – P.6124-
34.
21. Kakurin, L.I. [Text] Antiorthostatic hypokinesia as a method of weight- lessness simulation / L.I. Kakurin, V.I. Lobachik, V.M. Mikhailov, Y.A.
Senkevich / Aviat Space Environ Med. – 1976. – V.47. – P.1083–1086.
22. Lancaster, G.I., Febbraio, M.A. [Text] Exosome-dependent trafficking of HSP70: a novel secretory pathway for cellular stress proteins /G.I. Lan- caster, M.A. Febbraio / J Biol Chem. – 2005. –V.17. - №.280 (24). – P.23349-55.
23. Li, Z., Srivastava, P. [Text] Heat-shock proteins/ Z. Li, P. Srivastava / Curr Protoc Immunol. - 2004. - Appendix 1.
24. Lindquist, S. Craig, E.A. [Text] The heat-shock proteins/ S. Lindquist,
E.A. Craig /Annu Rev Genet. – 1988. – V.22. – P.631-77.
25. Yura, T. [Text] Regulation of the heat-shock response in bacteria / T.
Yura, H. Nagai, H. Mori /Annu Rev Microbiol. – 1993. – V. 47. – P.321-50.
26. Mambula, S.S., Calderwood, S.K. [Text] Heat shock protein 70 is se- creted from tumor cells by a nonclassical pathway involving lysosomal endosomes/ S.S. Mambula, S.K. Calderwood /J. Immunol. – 2006. – V.1.
- №.177 (11). – P.7849-57.
27. Morey, E.R. [Text] Spaceflight and bone turnover: correlation with a new rat model of weightlessness/ E.R. Morey / Bioscience. - 1979. – V.29. - P.168–172.

28. Morey-Holton, E.R., Globus, R.K. [Text] Hindlimb unloading rodent
model: technical aspects / E.R. Morey-Holton, R.K. Globus / J Appl Physiol. - 2002. – V. 92. - №.4. – P.1367-77.
29. Morey-Holton. E., Wronski, T.J. [Text] Skeletal alterations in rats during
space flight / E. Morey-Holton, T. J. Wronski, , W.S. Jee / Adv Space Res. – 1981. – V.1. - №.14. – P.13 5-40.
30. Mortaz, E. [Text] Induction of HSP70 is dispensable for anti-inflamma- tory action of heat shock or NSAIDs in mast cells /E. Mortaz, F.A. Re- degeld, N. Bloksma, K. Dunsmore, A. Denenberg, H.R. Wong, F.P. Ni-
jkamp, F. Engels / Exp Hematol. – 2006. – V.34. - №.4. - P.414-23.
31. Musacchia, X.J. [Text] A model for hypokinesia: effects on muscle atro- phy in the rat / X.J. Musacchia, D.R. Deavers, G.A, Meininger / J Appl
Physiol. – 1980. – V. 48. - P. 479–486.
32. Nollen, E.A., Morimoto, R.I. [Text] Chaperoning signaling pathways: molecular chaperones as stress-sensing 'heat shock' proteins /E.A. Nollen,
R.J. Morimoto / J Cell Sci. – 2002. – V. 115. – P. 2809-16.
33. Parmiani, G. [Text] Heat shock proteins and their use as anticancer vac- cines / G. Parmiani, A. Testori, M. Maio , C. Castelli, L. Rivoltini, L. Pilla, F. Belli, V. Mazzaferro, J. Coppa, R. Patuzzo, M.R. Sertoli,
A. Hoos, P.K. Srivastava, M. Santinami / Clin Cancer Res. – 2004. –
V.10. - №. 24. – P. 8142-6.
34. Philpott, D.E. [Text] Ultrastructural and cellular mechanisms in myocar- dial deconditioning in weightlessness / D.E. Philpott, K. Kato K., J.
Miquel /Adv Space Biol Med. – 1992. – V.2. – P. 83-112.
35. Schmitt, I. [Text] 6-MSAS-like polyketide synthase genes occur in lich- enized ascomycetes / I. Schmitt, S. Kautz, H.T. Lumbsch / Mycol Res. –
2007. – V. 112. – P.289-96.
36. Shellock, F.G. [Text] Early central venous pressure changes in the rat dur- ing two different levels of head-down suspension / F.G. Shellock, H.J. Swan, S.A. Rubin / Aviat Space Environ Med. – 1985. – V. 56. - №.8. –
P.791-5.
37. Sun, J. [Text] Changes of characteristics of preoptic neurons and NA metabolism in hypothalamus of ground squirrel (Citelleus Dautieus) in

different seasons and hibernating phases / J. Sun, Y. Ma, Z. Xu, W. Zhao,
J. Dong, Y. Cai / Sci China C Life Sci. – 1998. – V. 41(5). – P.488-97. 38.Thomason, D.B. [Text] Activity influences on soleus muscle myosin dur-
ing rodent hindlimb suspension / D.B. Thomason, R.E. Herrick, K.M. Baldwin / J Appl Physiol. - 1985. – V. 63(1). – P. 138-44.
39. Wu, H. [Text] Optimization of composite transducer designing in high
frequency applications / H. Wu, J. Lin, H. Gao, Y. Shui, Q. Xue / IEEE Trans Ultrason Ferroelectr Freq Control. – 2000. – V. 47(6). – P. 1610-4.
40. Yajid, F. [Text] Effects of 4 wk of hindlimb suspension on skeletal mus-
cle mitochondrial respiration in rats / F. Yajid, J.G. Mercier, B.M. Mercier, H. Dubouchaud, C. Préfaut / J Appl Physiol. – 1998. – V. 84(2).
– P.479-85.
41. Yang, R. [Text] Experimental study on erythrocyte of obstructive jaun- dice patient: its changes of membrane protein and mechanical properties /
R. Yang, Y. Wu, J. Jiang, Z. Wu, M. Long, Y. Wu / Sheng Wu Yi Xue
Gong Cheng Xue Za Zhi. – 1997. – V. 14(3). – P. 274-8.
42. Zhang S.Z., [Text] A study on the interaction between concanavalin A and glycogen by light scattering technique and its analytical application /
S.Z. Zhang, F.L. Zhao, K.A. Li, S.Y. Tong / Talanta. – 2001. – V. 54(2). –
P. 333-42.
43. Zhang Z.Y., [Text] Catalytic function of the conserved hydroxyl group in the protein tyrosine phosphatase signature motif / Z.Y. Zhang, B.A. Palfey, L. Wu, Y. Zhao / Biochemistry. – 1995. – V. 34. - №.50. – P.16389-96.