ИССЛЕДОВАНИЕ ФИЗИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ГИДРОЛИЗАТА КОЛЛАГЕНА, ПОЛУЧЕННОГО ИЗ ПЛАВАТЕЛЬНОГО ПУЗЫРЯ СЕВЕРНЫХ РЫБ

Актуальность. Коллаген считается одним из самых полезных биоматериалов. Отличная биосовместимость и безопасность благодаря биологические характеристики, такие как биоразлагаемость и слабая антигенность, сделали коллаген основным ресурсом в медицинские применения. Основными применениями коллагена в качестве систем доставки лекарств являются коллагеновые оболочки в офтальмологии, губки для ожогов / ран, мини-гранулы и таблетки для доставки белка, гелевая композиция в сочетании с липосомы для непрерывной доставки лекарств, в качестве контрольного материала для трансдермальной доставки и наночастиц для гена доставки и базовых матриц для систем клеточной культуры. Он также использовался для тканевой инженерии, включая замену кожи, заменители костей, искусственные кровеносные сосуды и клапаны.
Образование коллагеновых волокон из ступенчатых субфибрилл все еще не имеет общепринятой модели. Определение механические свойства отдельных коллагеновых фибрилл (диаметр 50-200 нм) дают новое представление о структуре коллагена. В этом работа, уменьшенный модуль коллагена измеряли наноиндентированием с использованием атомно-силовой микроскопии. Для индивидуального типа 1 коллагеновых фибрилл от хвоста крысы, модуль оказался в диапазоне от 5 ГПа до 11,5 ГПа (в воздухе и при комнатной температуре).
Гипотеза о том, что анизотропия коллагена обусловлена выравниванием субфибрилл вдоль оси фибрилла, поддерживается неоднородной поверхностные отпечатки, выполненные с помощью наноиндентификации с высокой нагрузкой.
Цель работы: Разработка технологии получения гидролизата коллагена из плавательного пузыря рыб, исследование свойств и областей применения полученного продукта.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
Изучить литературу по данной теме;
Раскрыть объекты и методы исследования;
Выявить и обсудить результаты исследования.

Глава I.Литературный обзор 5
1.1 Коллаген, структура и его свойства 5
1.2 Рыбный коллаген 15
1.3 Применение коллагена 15
Глава II. Объекты и методы исследования 18
2.1 Объекты исследования 18
2.2 Методы исследования 18
2.2.1 Диализ 18
2.2.2 Метод лиофильной сушки 19
2.2.3 ИК-спектроскопия 20
2.2.4 Динамическое рассеяния света 23
2.2.5 Определение дзета-потенциала 27
2.2.6 Вискозиметрический метод определения молекулярной массы коллагена 29
2.2.7 Растровая электронная микроскопия 31
Глава III. Обсуждение результатов исследования 33
3.1 Определение технологических режимов получения белковых гидролизатов коллагена из плавательного пузыря осетра и омуля 33
3.2 Способ получения гидролизата коллагена 34
3.3 Диализ 34
3.4 Лиофильная сушка 34
3.5 Исследование качественного химического состава методом ИК- спектроскопии 35
3.6 Определение размера частиц и дзета- потенциала гидролизтата коллагена методом ДРС спектроскопии 38
3.7 Определение молекулярной массы гидролизата коллагена из плавательного пузыря осетра и омуля вискозиметрическим методом 40
3.8 Исследование структуры гидролизата коллагена методом электронной микроскопии 41
Выводы 42
Список использованной литератур 43

Глава I.Литературный обзор
1.1 Коллаген, структура и его свойства

Коллаген является основным структурным материалом позвоночных животных и является наиболее распространенным млекопитающим белок составляет около 20-30% всего тела белки. Он присутствует в тканях прежде всего механической. Около половины общий коллаген тела находится в коже и около 70% материала, отличного от воды, присутствующей в дерме кожи и сухожилия - коллаген. Коллаген сделал свой появление на ранней стадии эволюции в таких примитивные животные как медузы, кораллы и моря анемоны. Синтезирован коллаген фибробластами, которые обычно происходят из плюрипотентные адвентициальные клетки или клетки ретикулума.
Образование коллагеновых волокон из ступенчатых субфибрилл все еще не имеет общепринятой модели. Определение механических свойств отдельных коллагеновых фибрилл (диаметр 50-200 нм) дает новое представление о структуре коллагена. В этой работе уменьшенный модуль коллагена измеряли путем наноиндентирования с использованием атомно-силовой микроскопии. Для отдельных коллагеновых фибрилл 1-го типа из хвоста крысы модуль был найден в диапазоне от 5 ГПа до 11,5 ГПа (в воздухе и при комнатной температуре). Гипотеза о том, что анизотропия коллагена обусловлена выравниванием субфибрилл вдоль оси фибрилла, подтверждается неоднородными отпечатками поверхности, выполненными с помощью наноиндентации высокой нагрузки.
Коллаген является наиболее распространенным структурным белком у млекопитающих. Это важный компонент соединительной ткани, кожи, кости, хряща и сухожилий. Хотя коллаген интенсивно изучается в течение десятилетий, по-прежнему отсутствует убедительная и всеобъемлющая структурная модель для фибрилл и волокон. На сегодняшний день широко используется упрощенная двумерная модель штабелирования, адаптированная из Ходжа и Петрушки (1). В модели пять молекул тропоколлагена расположены в шахматном порядке бок о бок со смещением D = 67 нм между двумя соседями. Так как длина молекулы не является точным кратным D, появляются области зазора и перекрытия (2), что приводит к характеристической картине D коллагеновых фибрилл, как видно из просвечивающей электронной микроскопии (3) и атомно-силовой микроскопии (АСМ) 4, 5 .. Были предложены различные трехмерные модели, включая модификации шахматной упаковки 6., 7., 8., 9. или трубчатую (10) или ропельную (11) структуру. Тем не менее, недавняя работа Orgel et al. (12) с использованием рентгеновской дифракции подтверждает идею о том, что пять ступенчатых тропоколлагеновых молекул расположены с правосторонним наклоном, а не просто в шахматном порядке, с образованием микрофибриллы.
Биологическая функция коллагена лежит преимущественно в его механических свойствах. Следовательно, существует фундаментальная необходимость определять их в разных масштабах и уровнях иерархии. Информация о механических свойствах коллагена не только необходима для объяснения макроскопической биофизики различных тканей, но также может способствовать нашему пониманию микроскопической структуры самих коллагеновых фибрилл. Например, любая анизотропия или неоднородность коллагеновых фибрилл, вероятно, проявится в соответствующей анизотропии и неоднородности их механических свойств. Обычные макроскопические технические инструменты, основанные на прямой манипуляции и визуальном наблюдении для определения механических свойств, нелегко применимы к фибриллам наноразмерных размеров (нанофибриллы). Тем не менее, несколько методов были успешно адаптированы к наномасштабированию, такие как прямые испытания на растяжение с помощью микроэлектромеханической системы 13. 14. Испытания на изгиб трехточечного изгиба подвешенного волокна 15., 16., силовая спектрометрия фибриллы, прикрепленной между поверхностью и AFM tip 2., 16., 17. и нанометрический отступ 16., 18., 19., 20., 21., 22., 23. Недавно сообщалось о жесткости коллагена типа 1 наноразмерным отступом (24 ) на примере морской огуречной ткани в воздухе и при комнатной температуре. Используя сферический наконечник (R Es). Следовательно, приведенное модуль определяется только модулем Юнга образец и содержит его коэффициент Пуассона Vs:

1. http://www.allchemistry.in.ua/sprav/sprav.html. Клеи, замазки, цементы.
2. http://www.klgtu.ru/ru/magazine В.И.Воробьев. Использование рыбного коллагена и продуктов его гидролиза.
3. Батечко С.А., Андриюк Т.А. Коллаген (InventiaPolishTechologes) Эликсир красоты и здоровья. — К.: "Червона Рута-Туре", 2006. — 200 с.
4. Хилькин А.М., Шехтер А.Б., Истранов Л.П., Леменев В.Л. Коллаген и его применение в медицине. М.: Медицина, 1976. – 256 с.
5. Северина Е.С. учебник: Биохимия – 2-е изд., испр. – М.: ГЭОТАР – МЕД, 2004. – 784 с.: ил. – (Серия XXI век).
6. Райх Г. Коллаген «Легкая индустрия» М., 1969
7. Шехтер А.Б., Истранов Л. П. – Архив патологи, 1970, 32, 3.
8. Ogle J.D., Arlinghaus R. B., Logan M. A. – Arch. Biochem., Biophys., 1961.
9. Кюн К. – В кН.: Современные биохимические и морфологические проблемы соединительной ткани. «Наука». СО АН СССР, Новосибирск, 1971.
10. Ikoma, T., Kobayashi, H., Tanaka, J., Walsh, D., & Mann, S. (2003). Physical properties of type I collagen extracted from fish scales of Pagrus major and Oreochromis niloiicas. International Journal of Biological Macromolecules, 32, 199–204.
11. Foegeding, E. A., Lanier, T. C., & Hultin, H. O. (1996). Collagen. In O. R. Fennema (Ed.), Food chemistry (3rd ed., pp. 902–906). New York: Marcel Dekker, Inc.
12. Ramachandran, G. N. (1988). Stereochemistry of collagen. Journal of Peptide Protein Research, 31, 1–16.
13. Asghar, A., & Henrickson, R. L. (1982). Chemical, biochemical, functional and nutritional characteristics of collagen in food systems. In C. O. Chichester, E. M. Mrata, & B. S. Schweigert (Eds.), Advances in food research (Vol. 28, pp. 237–273). London: Academic Press.
14. Stimler, N. P., & Tanzer, M. L. (1977). Location of the intermolecular crosslinking sites in collagen. In M. Friedman (Ed.), Protein crosslinking nutritional and medical consequences (pp. 133–157). New York: Plenum Press.
15. Phanat Kittiphattanabawon, Soottawat Benjakul, Wonnop Visessanguan, Takashi Nagai, Munehiko Tanaka «Characterisation of acid-soluble collagen from skin and bone of bigeye snapper (Priacanthus tayenus) », 2004.
16. Kittiphattanabawon, P., Benjakul, S., Visessanguan, W., Kishimura, H., & Shahidi, F. (2010). Isolation and characterisation of collagen from the skin of brownbanded bamboo shark (Chiloscyllium punctatum). Food Chemistry, 119, 1519–1526.
17. Muyonga, J. H., Cole, C. G. B., & Duodu, K. G. (2004). Characterisation of acid soluble collagen from skins of young and adult Nile perch (Lates niloticus). Food Chemistry, 85, 81–89.
18. Johnston-Banks, F. A. (1990). Gelatin. In P. Harris (Ed.), Food gels (pp. 233–289). London: Elsevier Applied Science.
19. Wong, D. W. S. (1989). Mechanism and theory in food chemistry. New York: Van Nostrand Reinhold.
20. Owusu-Apenten, R. K. (2002). Food protein analysis. New York: Marcel Dekker, Inc.
21. Zhang, Y., Liu, W., Li, G., Shi, B., Miao, Y. Q., & Wu, X. H. (2007). Isolation and partial characterisation of pepsin-soluble collagen from the skin of grass carp (Ctenopharyngodon idella). Food Chemistry, 103, 906–912.
22. Prabjeet Singh, Soottawat Benjakul, Sajid Maqsood, Hideki Kishimura.
23. http://www.art-con.ru/node/974.
24. Иванова Л.А., Сыченников И.А., Кондратьева Т.С. Коллаген в технологии лекарственных форм. – М.: Медицина, 1984, 112 с., ил.
25. Р. Марри, Д. Греннер, П. Мейес, В. Родуэлл. Биохимия человека: в 2 томах. – М.: Мир; БИНОМ. Лаборатория знаний, 2009. Т. 2. – 414 с.: ил.
26. Каспарьянц С.А. Современные представления о структуре и свойствах коллагена. - М.: МВА, 1986.
27. http://seondo.com/blog/article/Pochemu_rybnyy_kollagen_luchshe_zhivotnogo.
28. Репников Б.Т. Товароведение и биохимия рыбных товаров. Товароведение и биохимия рыбных товаров: Дашков и К; Москва; 2007. – 146 с.
29. Денисова А. А., Андреев С. Д. – В кН.: Современные биохимические и морфологические проблемы соединительной ткани. «Наука», СО АН СССР, Новосибирск, 1971.
30. Мазуров В. И. Биохимия коллагеновых белков. М.: "Медицина", 1974. - 248 с.
31. Шехтер А. Б., Хилькин А. М., Сычеников И. А., Леменев В. Л., Дронов А. Ф., Аракчеев Д Г. – В кн.: Современные биохимические и морфологические проблемы соединительной ткани. «Наука», СО АН СССР, Новосибирск, 1971.
32. Гулый М. Ф., Молекулярная биология II выпуск «Биополимеры в биологии, народном хозяйстве и медицине». Издательство «Наукова дома», Киев.
33. http://www.klgtu.ru/ru/magazine.
34. http://www.medy.ru/pages.php?id=1851&page=9.
35. Машковский М.Д. Лекарственные средства. – 15-е изд., перераб., испр. и доп. – М.: ООО «Издательство Новая Волна», 2005. – 1200 с.: ил.
36. Верболович В.П. Инфракрасная спектроскопия биологических мембран. Издательство «Наука» 1977. с. 115.
37. Морилл Т, Фьюзон Д, Шрайнер Р. Пер. с англ. Идентификация органических соединений: – М.: Мир, 1983. с. 704.
38. https://ru.wikipedia.org/wiki/Инфракрасная_спектроскопия.
39. http://www.alkorbio.ru/katalogproduktsii/liofilnayasushka0.html.
40. Васильева И.О. Диссертация. Разработка технологии мясного продукта с использованием биологически активного композита на основе модифицированного коллагена и минорного нутриента. Москва 2014.
41. Лиофилизация. Принцип и сущность метода. Презентация twirpx.com 2015.
42. International standard ISO13321 (1996) Methods for determination of particle size distribution part 8: photon correlation spectroscopy. International Organization for standardization (ISO).
43. Peters R (2000) fibre optic device for detecting the scattered light of fluorescent light from a suspension. US Patent 6,016,195.
44. Stryer L (2002) Biochemistry. W.H. Freeman, New York.
45. Willemse, A.: Optical measuring techniques for particulate systems at the fringes of concentration. Ph.D. thesis, TU Delft, 1998.
46. Michael Kaszuba- David McKnight. научная статья. Springer- Business Media B.V. 2007. Измерение размеров частиц в субнанометровом диапазоне методом динамического рассеяния света.
47. Способ получения сухого рыбного коллагена: пат. 2232515 Рос. Федерация. № 2002113968/13; заявл. 28.05.2002; опубл. 20.07.2004.
48. ГОСТ Р 8.887-2015 Государственная система обеспечения единства измерений (ГСИ). Потенциал электрокинетический (дзета-потенциал) частиц в коллоидных системах. Оптические методы измерения.
49. Тагер А.А. Физикохимия полимеров. М.: Химия, 1978. 544 с.
50. И.Шиян, Я.Припаньковская. Кубанский государственный технологический университет Краснодар, Россия. Вискозиметрический метод определения молекулярной массы. «Определение молекулярной массы желатина вискозиметрическим методом».
51. Способ получения белкового продукта из коллагенсодержащего сырья: пат. 2227507 Рос. Федерация. заяв. 05.07.2002; опуб. 27.04. 2004.
52. Способ получения коллагена: пат. RU 2076718: заявл.09.04.1993; опубл.10.04.1997.
53. Способ получения коллагеновой губки: пат. RU 2039766. №93014480/05: завл. 19.03.1993; опубл. 20.07.1995.
54. Способ получения коллагена: пат. 2129805 Рос. Федерация. № 97121210/13; заявл. 30.12.1997; опубл. 10.0.1999.
55. Инфракрасная спектроскопия биологических мембран (применение в хирургии и анестезиологии). В.П. Верболович, Алма-Ата, «Наука» КазССР,1977г.
56. https://ru.wikipedia.org/wiki/Растровый_электронный_микроскоп.
57. Ешкайт Х, Якубке Х. Аминокислоты, пептиды, белки: Пер. с нем. - М.: Мир, 1985. с. 456.
58. https://ru.wikipedia.org/wiki/Диализ.