ЭНДОГЕННЫЙ АМИНОКИСЛОТНЫЙ ПРОФИЛЬ МАТРИКСА МИТОХОНДРИЙ ПРИ ОКИСЛИТЕЛЬНОМ СТРЕССЕ

ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ 3
ВВЕДЕНИЕ 4
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
1.1 Окислительный стресс и механизмы образование свободных радикалов 8
1.2 Причины окислительного стресса 9
1.3 Изменения в организме при оксидативном стрессе 10
1.4 Антиоксидантная система организма 14
1.4.1 Жирорастворимые антиоксиданты 15
1.4.2 Водорастворимые антиоксиданты 17
1.5 Энерготропные препараты 20
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 27
2.1 Материалы исследований 27
2.1 Оборудование и реактивы 27
2.3 Подготовка проб 28
2.4 Методы исследований 29
2.5 Математическая обработка результатов 29
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 30
3.1 Изменение содержания свободных аминокислот и их метаболитов в матриксе митохондрий под действием различных окислителей in vitro 30
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 40
ВЫВОДЫ 41
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК 42

ВВЕДЕНИЕ
Актуальной задачей системной биологии является поиск реакций, существенных для организации метаболических потоков, и определение способов регуляции таких реакций с целью изменения всего метаболизма клетки и организма. Относительная автономность митохондрий и их значительная роль в процессах клеточной жизнедеятельности и смерти позволяет изучать ряд существенных метаболических функций и параметров клетки на удобном для исследователя уровне клеточной подсистемы. Наследственное или приобретенное нарушения структуры митохондрий играют определяющую роль в патогенезе таких социально значимых заболеваний, как атеросклероз, диабет, нейродегенеративные заболевания – болезнь Паркинсона, Альцгеймера [1], токсическое поражение ряда органов, а также процессов старения.
...

1.1 Окислительный стресс и механизмы образование свободных радикалов
Окислительный стресс может быть определен как неустойчивое состояние между прооксидантами и антиоксидантами. Прооксиданты элементы включают все факторы, которые играют активную роль в повышенном образовании свободных радикалов или других реактивных видов кислорода. В этих процессах могут участвовать как клеточные механизмы (дефекты в митохондриальном дыхании, специфические ферменты), так и экзогенные механизмы (курение, загрязнение воздуха, лекарства и т.д.) [3].
В организме человека постоянно образуются свободные радикалы кислорода и перекиси водорода. Некоторая часть этих процессов является химической случайностью, например, появление гидроксильных радикалов (OН) из-за постоянной подверженности низким уровням ионизирующего излучения из окружающей среды и выделение супероксидного радикала (О2–) за счет утечки электронов из цепи транспорта электронов.
...

1.2 Причины окислительного стресса
В организме здорового человека существует нормальный баланс между образованием производных кислорода и антиоксидантной защитой. Из этого следует, что есть, по крайней мере, две причины развития окислительного стресса: снижение количества антиоксидантов или повышение образования производных кислорода таким образом, что антиоксиданты уже не могут справляться с защитой [6].
Хорошо известно, что антиоксидантная защита в большей мере зависит от адекватного питания, и в связи с этим становится очевидным, что недостаточность питания может привести к окислительному стрессу. По-видимому, многие болезни человека являются результатом дефицита антиоксидантных нутриентов, например, нейродегенерация в результате длительного дефицита витамина Е у пациентов, организм которых не способен должным образом усваивать жиры.
...

1.3 Изменения в организме при оксидативном стрессе
Окислению при оксидативном стрессе подвергаются не только липиды биологических мембран в процесс включаются углеводы и белки. Также изменения идут в эндокринной и гормональной системе. Снижается активность энзимной системы лимфоцитов тимуса, увеличивается уровень нейромедиаторов, высвобождаются гормоны. Идёт окисление протеинов, нуклеиновых кислот, углеводов, увеличивается общее количество липидов в сыворотке крови. Увеличивается выброс адренокортикотропного гормона в связи с увеличением распада АТФ и образование цАМФ при этом последний активирует протеинкиназу которая при участии АТФ осуществляет фосфорилирование холинэстеразы, превращающий эфиры холестерина в свободный холестерин. Усиливается биосинтез белка, ДНК, РНК, гликогена и в тоже время идёт мобилизация жиров из депо и распад высших жирных кислот и глюкозы в тканях. Эти процессы идут под действием гормона соматотропина.
...

1.4 Антиоксидантная система организма
Супероксиддисмутаза: пероксидоксиредуктаза, которая инактивирует супероксидный анион-радикал О2––. В итоговой реакции образуется пероксид водорода, способный инактивировать супероксиддисмутазу. Поэтому последняя локализована и функционирует в содружестве с каталазой, которая быстро и эффективно разлагает перекись водорода. Наиболее распространённая форма супероксиддисмутазы находится в цитозоле клетки и интермембранном пространстве митохондрий. Супероксиддисмутаза относится к наиболее устойчивым ферментам и в связи с этим подкожное введение её больным животным и человеку, подвергающихся, например, лучевому облучению, существенно снижает воспалительную и лучевую реакцию в зоне облучения [9].
Каталаза – пероксид водорода: пероксид водорода оксиредуктаза разлагает пероксид водорода. Реакция разложения протекает в две стадии: сначала образуется комплекс фермента с одной, а затем с другой молекулой пероксида водорода.
...

1.4.1 Жирорастворимые антиоксиданты
Вслед за цитохром С-оксидазой и антиоксидантными ферментами клетки третью линию защиты осуществляют вещества, обладающие антирадикальной и антипероксидной активностью и находящиеся там, где расположены субстраты-мишени атаки свободных радикалов и пероксидов. В первую очередь, это такие места, как биологические мембраны, а мишени – это полиненасыщенные жирные кислоты: линолевая, линоленовая и арахидоновая. Поэтому в структуру плазматических, митохондриальных, микросомальных, лизосомальных мембран встроены жирорастворимые антиоксиданты. К которым относятся: токоферол, убихинон, витамин А [7].
Токоферол – это подвижный гидроксил который в положении 6 хроманового ядра молекулы α-токоферола непосредственно взаимодействует с пероксидами и свободными радикалами с образованием токоферолхинона и димеров α-токоферола, прерывая тем самым процесс свободно радикального пероксидного окисления липидов.
...

1.4.2 Водорастворимые антиоксиданты
Присутствие в жидких средах организма легкоокисляющихся липидных образований (липопротеины крови, хиломикроны, холестерин, триглицериды, фосфолипиды) увеличивают опасность окисления активными формами кислорода и поэтому существуют специализированные антиоксидантные системы, ответственные за стабильность прооксидантно-антиоксидантного равновесия жидкостных сред организма. К их числу относятся: система восстановленный-окисленный глутатион, система аскорбиновой кислоты, фенольные соединения. Каждая из этих систем представляет собой окислительно-восстановительную буферную систему, состоящую из восстановленного и окисленного членов, переходящих друг в друга в зависимости от колебаний параметров среды и направленности метаболических процессов. В нормальных условиях равновесие внутри каждой из редокс-систем сильно сдвинуто в сторону восстановленного субстрата. Преобладание последних и образуют антиоксидантный резерв, буферную ёмкость систем [14].
...

1.5 Энерготропные препараты
К низкомолекулярным эндогенным соединениям относится большая группа природных веществ с относительно небольшой молекулярной массой и высокой биологической активностью, выполняющих разнообразные функции в живых организмах: терпеноиды, стероиды, витамины, флавоноиды, простагландины, антибиотики, алкалоиды и ряд других соединений [13]. Значительная часть низкомолекулярных биорегуляторов является изопреноидами.
К ним относятся прежде всего терпеноиды и стероиды. Первые, как правило, имеют растительное происхождение, вторые преобладают в животном мире. Между ними много общего, например, в их структурах присутствуют одинаковые пятиуглеродные изопреновые фрагменты, а их биосинтез включает одни и те же промежуточные соединения. Один из наиболее известных представителей изопреноидов – натуральный каучук - представляет собой полимер изопрена.
...

2.1 Оборудование и реактивы
Для приготовления подвижных фаз для высокоэффективной жидкостной хроматографии использовался ацетонитрил фирм AppliChem (Германия) и Panreac (Испания) с содержанием основного вещества не менее 98 %. Нормальные спирты:
– метанол для жидкостной хроматографии с содержанием основного вещества не менее 99 % (Merck, Германия);
– 2-пропанол с содержанием основного вещества не менее 99 %.
Остальные органические растворители для твердофазной экстракции и высокоэффективной жидкостной хроматографии имели квалификацию «осч», а химические реактивы, необходимые для дериватизации образцов и обработки биологического материала – зарубежного или российского производства квалификации не ниже «хч» (химически чистые).
...

2.3 Подготовка проб
Подготовку проб проводят путем механической гомогенизации суспензии митохондрий, в 5 кратном объеме среды для депротеинизации (содержащей 0,2М хлорную кислоту), с внутренним стандартом α-валериановой кислоты. После чего гомогенат подвергается центрифугированию при скорости вращения ротора 12000g, температуре равной 4 оС в течении 20 минут. Полученную надосадочную жидкость отбирают для анализа.


2.4 Методы исследований
Количественное определение свободных аминокислот и их метаболитов выполняли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в безбелковых хлорнокислых экстрактах образцов на аналитической колонке, заполненной обращенно-фазовым сорбентом Zorbax Eclipse XDB-C8, в режиме градиентного элюирования подвижной фазой на основе натрий-ацетатного буфера и органического модификатора ацетонитрила, при скорости потока элюента – 0,2 мл/мин, температуре анализа 38 °С и флуориметрическим детектированием при длине волны возбуждения – 231 нм и длине волны эмиссии – 445 нм.
В расчетах использовался метод анализа данных по внутреннему стандарту. В качестве внутреннего стандарта использовали δ-аминовалериановую кислоту (для определения остальных групп аминокислот).
Для качественной идентификации пиков соединений использовали, кроме критерия совпадения времен удерживания со стандартными, анализ их спектров поглощения.
...

3.1 Изменение содержания свободных аминокислот и их метаболитов в матриксе митохондрий под действием различных окислителей in vitro

Многочисленные исследования показали, что структурно-функциональные нарушения митохондрий являются одним из основных патогенетических звеньев, лежащих в основе возникновения и развития ряда заболеваний человека и животных. К основным проявлениям митохондриальной дисфункции относят снижение синтеза АТФ, продукцию активных форм кислорода, активизацию механизмов программированной гибели клетки, включая апоптоз, аутофагию и некрозоподобные изменения. Следствием этих процессов являются повреждение свободными радикалами мембранных структур клеток, подавление энергоемких процессов в клетках, развитие гипоэнергетического состояния, приводящего к нарушению функциональной активности клеток и как следствие к развитию процесса воспаления и повреждения ткани.
...

6. Болдырев, A.A. Убихинон. Биологическое значение и возможности применения в медицине / А.А. Болдырева. – Москва: Издательство Московского Университета, 1998. – 142 с.
7. Бурлакова, Е.Б. Перекисное окисление липидов мембран и природные антиоксиданты / Е.Б. Бурлакова. – Москва: Успехи химии, 1985. – 1540 с.
8. Ванин, А.Ф. Нитрозильные комплексы негемового железа в тканях животных и микроорганизмов / А.Ф. Ванин. - Москва: ИХФ, 1980. – 18 с.
9. Владимиров, Ю.А. Оценка антиокислительной и антирадикальной активности веществ и биологических объектов с помощью железоинициированной хелмилюминесценции / Ю.А. Владимиров [и др.]; под общей редакцией Ю.А. Владимиров. – Москва: Биофизика, 1992. – 1047 с.
и.т.д